Шкриль В'ячеслав Михайлович2024-05-092024-05-092024Шкриль В.М. Ріанодин рецептор опосередкована кальцієва сигналізація в м’язових і нервових клітинах. - Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису за сукупністю наукових статей. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика – Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2024.https://repository.biph.kiev.ua/handle/123456789/13У роботі представлені результати комплексного дослідження клітинних та молекулярних механізмів, які беруть участь у регуляції внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації у м’язових і нервових клітинах шляхом вивчення ролі ріанодинових рецепторів (RyRs). Ці рецептори відповідають за вивільнення кальцію з сарко/ендоплазматичного ретикулуму в цитозоль. Процес вивільнення кальцію з депо має велике значення для функціонування м'язів і нервової системи. На локальному рівні активність RyRs реєструється як кальцієві спалахи, які розглядалися як локальні зміни концентрації кальцію під час його вивільнення з саркоплазматичного ретикулуму (СР) внаслідок одночасного відкриття декількох RyRs. Розуміння динаміки Са2+ спалахів є важливою для кальцієвої сигналізації. Численні експериментальні, комп’ютерні та біофізичні дослідження були спрямовані на вивчення механізмів ініціації, припинення та регуляції кальцієвих спалахів. Розуміння ролі як спалахів, так і роботи залучених RyRs на рівні регуляції та динаміки кальцієвого сигналу у нормі та патології слугує основою для з’ясування функціональних змін Са2+ сигналу на клітинному або субклітинному рівнях. Актуальність досліджень ріанодинових рецепторів в кальцієвій сигналізації полягає в тому, що вони є потенційними мішенями для розвитку нових ліків від різних захворювань, пов'язаних з порушенням кальцієвої концентрації в клітинах. Наприклад, деякі хвороби м'язів, такі як дистрофія скелетних м’язових волокон, аритмії серця, а також нейродегенеративні захворювання, можуть бути пов'язані зі зміною функціональності RyRs. Для детального дослідження ріанодин рецептор опосередкованої кальцієвої сигналізації було застосовано наступні біофізичні методики: епіфлуоресценція та конфокальна мікроскопія з використанням кальцій-чутливих флуоресцентних барвників для визначення динаміки концентрації кальцію; метод петч-клемп для реєстрації трансмембранних Ca2+ струмів; локальне вивільнення зв'язаного кальцію під час фотолізного спалаху з кальцієвого буфера; комп'ютерне моделювання та обробка кальцієвих сигналів для розрахунку кальцієвих потоків; статистична обробка отриманих результатів. У даному дослідженні властивості кальцієвих спалахів у кардіоміоцитах передсердь були вперше досліджені за допомогою чотиривимірної конфокальної мікроскопії. Були запропоновані алгоритми для виявлення спалахів Са2+ у місці вивільнення. Попередньо під час конфокального сканування ліній або площини клітини спонтанні Са2+ спалахи реєструвалися розфокусованими, оскільки місце їхнього виникнення невідомо. В даній роботі зареєстровані спалахи, які знаходилися в місці вивільнення, мали вищу амплітуду порівняно з іншими розфокусованими спалахами. Було показано, що амплітуда Са2+ спалахів зареєстрованих у місці вивільнення мали модальний розподіл. Струм вивільнення Са2+, що лежить в основі такого спалаху, становив приблизно 11 пА, що свідчить про активність між 20 та 30 відкритими RyRs. Ця методика дозволяє досліджувати RyRs, визначати потік вивільнення з великою достовірністю, що дає можливості використати її для фармакологічних досліджень ріанодинових рецепторів. Для детального вивчення динаміки кальцію в кардіоміоцитах із високою часовою роздільною здатністю була застосована методика надшвидкісної конфокальної візуалізації. Це дозволило виявити ступінчасту кінетику зростаючої фази спалахів Са2+, та підтвердити участь групи каналів RyRs. Двовимірна реєстрація транзієнтів Са2+ в міоцитах шлуночка демонструє асинхронну активацію сайтів вивільнення, при відкритті RyRs. З латентністю в 2.5 мс після подачі електричного стимулу спостерігався вхід Са2+, який супроводжувався вивільненням Са2+ з СР з додатковою затримкою в 3 мс. Пік вивільнення Са2+ спостерігався через 4 мс після його початку. Показано, що динаміку збільшення Ca2+, який входить у кардіоміоцит та кальцій-індукованого вивільнення кальцію можливо достовірно розділити на рівні окремих центрів вивільнення кальцію як у клітинах передсердя, так і у шлуночків міокарда, як у часі, так і просторі. Було отримано перші прямі докази того, що в міоцитах передсердь зміна кінетики реституції вивільнення Ca2+ з саркоплазматичного ретикулуму від стимулу до стимулу є ключовим причинним механізмом виникнення Ca2+-альтернацій, як важливий механізм утворення серцевої аритмії. Показано, що просторово обмежене фотовивільнення Са2+ та інозитол-3-фосфату дозволяє регулювати активність RyRs через механізм кальцій-індукованого вивільнення кальцію (CICR). Це додатково може допомогти вивчити альтернації серця, та надає можливості розробки нових стратегій лікування аритмій серця. В даній роботі було ідентифіковано мікродомени в скелетних м'язах, де кальцій, що вивільняється з СР, має прямий доступ до мітохондрій. Була виявлена кореляція між активністю RyRs та окислювально-відновним потенціалом мітохондрій у клітинах скелетних м'язів, як фактор появи спонтанних кальцієвих спалахів. Встановлено, що активні форми кисню можуть регулювати RyRs та вивільнення Ca2+ із СР. Надмірне утворення ROS та аномальні сигнали Ca2+ в дистрофічних скелетних м'язах є взаємопов'язаними явищами, утворюючи порочне коло шкідливих подій, які сприяють аномальній чутливості при осмотичному стресі. Було виявлено значно збільшену експресію NAD(P)H-оксидази у скелетних м'язах миші лінії mdx, що сприяло підвищеному утворенню ROS. При осмотичному шоці, додатково відбувається збільшення мітохондріального кальцію та посилення утворення мітохондріального ROS в mdx скелетних м’язових волокнах порівняно з нормальними. Кальцій-індуковане вивільнення кальцію, яке відбувається через активацію RyRs кальцієм, було досліджено за допомогою методу штучного локалізованого підвищення концентрації кальцію (SLICs) на м'язових волокнах амфібій та ссавців. В скелетних м'язових клітинах жаби SLICs індукували CICR-відповіді з пороговим значенням [Ca2+] для ініціації реакції на рівні 0.5 мкМ, підтверджуючи роль CICR за фізіологічних умов у скелетних м'язах амфібій. Проте у скелетних м'язових волокнах миші було зафіксовано, що RyRs не активуються при концентрації кальцію аж до 8 мкМ. Це, разом з високим пороговим значенням активації RyRs, може пояснювати слабку реакцію вивільнення кальцію, навіть за умов, що агенти, які активують RyRs, були присутні в великих концентраціях. Це суперечить гіпотезі про фізіологічну роль CICR у механізмі збудження-скорочення у скелетних м’язах ссавців. Дослідження ролі ріанодинових рецепторів у регуляції внутрішньоклітинного кальцієвого сигналу в пірамідних нейронах гіпокампу показало, що відповіді на електричну стимуляцію включають в себе кальцієві сигнали, подібні до тих, що спостерігаються в міоцитах передсердь. Аналіз показав асинхронний та затриманий ріст концентрації вільного кальцію в окремих ділянках нейрона. Було зафіксовано затримку у зростанні концентрації вільного Ca2+ в центральній ділянці порівняно з примембранними ділянками та дендритного дерева. Активація ріанодинових рецепторів за допомогою кофеїну призводила до швидкого збільшення [Ca2+] у примембранній зоні, дендритному дереві та центральній ділянці. Більш коротка електрична стимуляція не викликала збільшення сигналу Ca2+ через кальцій-індуковане вивільнення кальцію. Для вивільнення кальцію з ендоплазматичного ретикулуму через RyRs була необхідна тривала електрична стимуляція. Порушення регуляції функції RyRs пов'язане з різними захворюваннями, і розуміння механізмів, які регулюють активність RyRs, має вирішальне значення для розробки терапевтичних стратегій. Результати цього дослідження не тільки поглиблять наше розуміння фундаментальних принципів внутрішньоклітинної Ca2+ сигналізації, але надають уявлення про молекулярну основу різних захворювань, пов'язаних з дисфункцією RyRs. Був запропонований новий метод просторової, складної, дифракційно-обмеженої фотоактивації та фотовивільнення в живих клітинах. Така методика дозволяє локально активувати окремі сайти вивільнення кальцію або групу RyRs каналів у живих клітинах, що може бути використано для вивчення їхніх структурних і функціональних деталей з високою точністю. Також була адаптована та модифікована формула Грінкевича для визначення вмісту вільного кальцію в клітині при двох хвильовому методі збудження флуоресцентного барвника, при використанні для реєстрації сигналів ПЗЗ камерою. Адаптація включає в себе корекцію фотознебарвнення та виправлення помилки віднімання фону. Також був розроблений підхід, який розширює чутливість кількісної концентраційної візуалізації до приблизно 1000-кратного діапазону концентрацій і з необхідними рівняннями для інтерпретації флуоресцентних зображень, отриманих за допомогою пари флуоресцентних барвників з однаковим флуорофором, але різною константою дисоціації для кальцію. Отримані дані щодо змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію в м’язових і нервових клітинах, вказують на складний процес регуляції кальцієвого сигналу. Мітохондрія, залежно від її функціональної близькості до СР, бере активну участь у регуляції внутрішньоклітинної концентрації кальцію і може модулювати активність RyRs через механізми, що включають АТФ і ROS. Регуляція кальцієвого сигналу відбувається завдяки змінам активності ріанодинових рецепторів, які модифікують своє функціонування через зміну окислювально-відновного потенціалу мітохондрій, впливу активних форм кисню, NAD(P)H-оксидази, а також в залежно від їхнього функціонального розташування на периферії або в центрі клітини, і модуляцію самим кальцієм.кальціймембранний транспортріанодинові рецепторикальцієві канали L-типумітохондріїАТФСа2+ та Mg2+-ATPaseактивні форми киснюокиснювальний стресм'язикардіоміоцитинейронипетч-клемпмікроскопіяThesis