Механізми функціонування імунокомпетентних та оваріальних клітин при активації імунної відповіді
No Thumbnail Available
Date
2026
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Дисертаційна робота присвячена дослідженню молекулярно-клітинних механізмів порушення функціонування імунокомпетентних та оваріальних клітин, що виникають за умов надмірної активації імунної відповіді. Актуальність такого дослідження зумовлена зростанням поширеності імуноопосередкованих та хронічних запальних розладів у жінок репродуктивного віку, що потребує поглибленого розуміння фізіологічних та клітинно-молекулярних змін, які виникають при імунній активації. Надмірна імунна активація супроводжується надлишковою продукцією прозапальних цитокінів, формуванням активних форм кисню та азоту, дисрегуляцією транскрипційних факторів і надмірною активацією механізмів клітинної відповіді на ушкодження ДНК. Ці зміни призводять до розвитку оксидативного та генотоксичного стресу, ушкодження ДНК та клітинної загибелі. Особливо чутливими до цих процесів є клітини тимуса, лімфатичних вузлів, а також гранулярні клітини та ооцити, що визначають стан фолікулогенезу і оваріального резерву. Оскільки такі ушкодження є ключовими факторами, що зумовлюють зниження їх репродуктивного потенціалу та імунної резистентності, їх вивчення має важливе фундаментальне і прикладне значення.
У роботі використано широкий спектр сучасних експериментальних та аналітичних методів, зокрема культивування ооцитів in vitro, виділення імунокомпетентних та гранулярних клітин, цитоморфологічні дослідження, метод лужного гель-електрофорезу поодиноких клітин (ДНК-комет) для оцінки інтегральної цілісності ДНК, прижиттєве флуоресцентне забарвлення нуклеїнових кислот для аналізу життєздатності клітин, апоптозу та некрозу, імуноцитохімічне визначення полі(АДФ-рибози) для оцінки активації ПАРП-1, аналіз маркерів оксидативного стресу (вміст МДА), кисневозалежного метаболізму нейтрофілів за НСТ-тестом та кисневонезалежних механізмів за вмістом катіонних білків, а також оцінку біохімічних показників ушкодження печінки (АЛТ), дослідження експресії генів HAS2, COX2 та GREM1 методом полімеразної ланцюгової реакції, імуноблотинг та імуноцитохімічний аналіз для оцінки активації NF-κB, а також статистичні методи для обробки, інтерпретації та підтвердження достовірності отриманих результатів.
Перший розділ експериментальної частини роботи присвячено оцінці адекватності застосованих експериментальних підходів для моделювання надмірної активації імунної відповіді, що охоплює гуморальну, клітинну та вроджену ланки імунітету: модель імунокомплексного ушкодження, індукованого БСА, модель КонА-індукованого Т-клітинного гепатиту, модель системної ендотоксемії, індукованої ЛПС. Це дозволило комплексно оцінити інтегральну цілісність ДНК, шляхи клітинної загибелі, інтенсивність оксидативного стресу, активацію ключових молекулярних медіаторів і сигнальних шляхів, а також вплив системного запалення на оваріальні клітини самиць мишей.
У моделі імунокомплексної патології, індукованої БСА, показано посилення клітинних і гуморальних реакцій імунної системи мишей. Імунофлуоресцентні дослідження підтвердили фіксацію імунних комплексів у тканині печінки, селезінки та аорти й їх накопичення в судинному руслі. Гістологічний аналіз цих органів виявив переважне ураження судинної системи та, меншою мірою, паренхіми. Встановлено підвищення функціонально-метаболічної активності клітин вродженого імунітету за умов дії БСА. Показано, що генералізований імунокомплексний процес призводить до ушкодження ДНК й загибелі імунокомпетентних клітин центральних і периферичних органів імунної системи, а також оваріальних клітин, що супроводжується збільшенням відсотка клітин із тяжкими формами фрагментації ДНК. Крім того, встановлено порушення мейотичного дозрівання та дисрегуляцію експресії генів HAS2, COX2 і GREM1, що відображає погіршення функціонального стану гранульозних клітин.
У моделі КонА-індукованого гепатиту, що відтворює Т-клітинно-опосередковане імунне ушкодження печінки, було підтверджено активацію клітинних механізмів запальної відповіді. За цих умов спостерігалося підвищення вмісту катіонних білків, зростання показників НСТ-тесту, збільшення рівня МДА, а також підвищення відсотка клітин із різним ступенем фрагментації ДНК. Гістологічні дослідження виявили дистрофічні зміни гепатоцитів, порушення структури тимуса та лімфатичних вузлів і формування масивних вогнищ некрозу. Отримані результати свідчать, що у моделі реалізуються як апоптотичні, так і некротичні шляхи клітинної загибелі, причому некроз має тенденцію до переважання та може бути пов'язаний з активацією ПАРП-1 і NF-κB.
У моделі ЛПС-індукованої ендотоксемії зареєстровано виражену активацію та дисфункцію клітин вродженого імунітету, посилення генерації активних форм кисню та збільшення частки клітин, що зазнають некротичної загибелі. Спостерігалося значне ушкодження ДНК і розвиток вираженого генотоксичного стресу, що супроводжувалося активацією некротичних механізмів клітинної загибелі із вивільненням DAMP-молекул, зокрема HMGB1 (амфотерину).
Другий розділ експериментальної частини роботи присвячено аналізу ролі ПАРП-1 — ключового ферменту відповіді на пошкодження ДНК, який, залежно від рівня генотоксичного стресу, здатний підтримувати геномну стабільність або зумовлювати розвиток некротичної клітинної загибелі. Показано, що за умов імунокомплексного ушкодження відбувається гіперактивація ПАРП-1, що супроводжується розвитком некрозу. У досліджуваних моделях застосування інгібіторів ПАРП-1 (3-амінобензаміду та 4-гідроксиквіназоліну) достовірно знижувало ступінь фрагментації ДНК та зменшувало відсоток клітин із некротичною загибеллю. Отримані дані свідчать, що фармакологічне пригнічення ПАРП-1 чинить виражений цитопротективний ефект у моделях імуноопосередкованого ушкодження, сприяючи збереженню життєздатності клітин тимусу та лімфатичних вузлів і обмежуючи розвиток некротичних процесів, характерних для надмірної активації ПАРП-1. В яєчнику встановлено також активацію ПАРП-1, зниження життєздатності гранулярних клітин, посилення апоптозу та некрозу, а також дисрегуляцію експресії генів, пов’язаних із мейотичним дозріванням, що супроводжувалося суттєвим зниженням якості ооцитів. Продемонстровано підвищену чутливість гранулярних клітин до системного запалення, що свідчить про значну роль оксидативного стресу в їх ушкодженні.
Третій розділ експериментальної частини роботи присвячено дослідженню ролі амфотерину. Показано його участь як DAMP-молекули, що вивільняється з клітин під час некрозу та посилює запалення через рецептори TLR і RAGE. Виявлено підвищення рівня амфотерину при ендотоксемії та його внесок у формування генотоксичного стресу і порушення цілісності ДНК імунокомпетентних клітин. Інгібітор амфотерину — гліциризинат амонію — зменшував інтегральне ушкодження ДНК та знижував частку некротичних клітин у моделі ЛПС, підтверджуючи ключову роль амфотерину у підтриманні запальної відповіді та генотоксичного стресу.
Четвертий розділ експериментальної частини роботи присвячено аналізу ролі NF-κB у розвитку імуноопосередкованих ушкоджень. Підтверджено значущу роль NF-κB у регуляції експресії генів прозапальних медіаторів і підтриманні запальної відповіді. У моделі КонА-індукованого гепатиту зафіксовано виражену транслокацію NF-κB до ядра гепатоцитів та імунних клітин, що свідчить про його залучення до Т-клітинно-опосередкованого ушкодження. Показано, що інгібітор ПАРП-1 4-ГК значно пригнічує активацію NF-κB за умов КонА-індукованого імуноопосередкованого процесу. Це супроводжувалося зменшенням ядерної локалізації p65 в клітинах печінки та імунокомпетентних органах. Андрографолід і куркумін продемонстрували виражений протизапальний ефект у моделі КонА-індукованого гепатиту, знижуючи некротичну загибель клітин. Крім того, за даними імуноблотингу встановлено, що андрографолід знижує активацію NF-κB.
П’ятий розділ експериментальної частини роботи присвячено комплексній оцінці широкого спектра фармакологічних засобів, здатних коригувати патологічні зміни, зокрема кверцетину, етилметилгідроксипіридин сукцинату (ГС), цитрату германію та наноструктурованих частинок срібла. Кверцетин зменшував ступінь ушкодження ДНК імунокомпетентних клітин при ЛПС-індукованому ушкодженні, що узгоджується з його антиоксидантними властивостями. Етилметилгідроксипіридин сукцинат покращував функціональний стан клітин імунної системи за умов імунокомплексного ушкодження, знижував інтенсивність оксидативного стресу та підтримував життєздатність гранулярних клітин і якість ооцитів. Цитрат германію та наночастинки срібла проявляли виражені антиоксидантні й мембранопротекторні властивості, знижували генотоксичний стрес, обмежували некроз і покращували структурно-функціональний стан імунних та оваріальних клітин. Отже, застосування антиоксидантів і наноматеріалів сприяло зниженню генотоксичного стресу, обмеженню некротичної загибелі клітин і покращенню функціонального стану імунних та оваріальних клітин.
У дисертаційній роботі вперше комплексно охарактеризовано роль ПАРП-1, амфотерину та NF-κB у механізмах розвитку імуноопосередкованих ушкоджень. Встановлено взаємозв’язок між ступенем ушкодження ДНК, рівнем оксидативного стресу та типом клітинної загибелі. Показано, що надмірна активація ПАРП-1 є ключовим чинником некротичної загибелі клітин, порушення клітинного гомеостазу та втрати функціональної активності. Виявлено нові аспекти впливу системного запалення на фолікулогенез, життєздатність гранулярних клітин та якість ооцитів. Обґрунтовано доцільність застосування інгібіторів ПАРП-1, та модуляторів амфотерину і NF-κB, а також антиоксидантів і наноструктурованих матеріалів для фармакологічної корекції імуноопосередкованих ушкоджень.
За результатами виконання роботи сформульовано наукову концепцію, що обґрунтовує ключову роль порушення інтегральної цілісності ДНК, надмірної активації ПАРП-1, дисрегуляції NF-κB та вивільнення амфотерину у розвитку імуноопосередкованих ушкоджень. Концепція визначає взаємозв’язок між генотоксичним стресом, характером клітинної загибелі та функціональним станом імунних та оваріальних клітин, а також передбачає, що цілеспрямована модуляція сигнальної осі ПАРП-1/амфотерин/NF-κB із застосуванням інгібіторів, антиоксидантів та наноструктурованих сполук є ефективною стратегією збереження геномної стабільності, обмеження некротичної загибелі та підтримання репродуктивної функції в умовах надмірної імунної активації.
У дисертації запропоновано підходи до фармакологічної корекції ушкоджень із використанням синтетичних інгібіторів ПАРП-1 та природних біологічно активних сполук. Експериментальні результати показали, що застосування цих засобів сприяло зниженню фрагментації ДНК, оксидативного стресу, а 4-ГК і андрографолід зменшували активацію NF-κB. Доведено, що така фармакологічна корекція супроводжується зменшенням некротичної загибелі клітин та відносним збільшенням рівня апоптотичної загибелі, що зменшує інтенсивність запальної відповіді й сприяє збереженню їх функціональної активності.
Уперше обґрунтовано доцільність модуляції сигнального шляху ПАРП-1/HMGB1 як перспективного напряму фармакологічної корекції імуноопосередкованих ушкоджень репродуктивної системи. Запропоновано концепцію використання ступеня фрагментації ДНК, рівня активації ПАРП за вмістом полі(АДФ-рибози) та показників оксидативного стресу як маркерів клітинної дисфункції, що створює наукове підґрунтя для розроблення нових діагностичних підходів.
Сформовано нові уявлення про механізми порушення репродуктивної функції при імуноопосередкованих розладах, що відкриває можливості для розробки індивідуальних профілактичних і терапевтичних підходів. Отримані дані поглиблюють сучасні знання щодо взаємодії імунної та репродуктивної систем, підкреслюючи необхідність комплексного підходу до збереження жіночого здоров’я за умов надмірної імунної активації. Генотоксичний стрес імунокомпетентних клітин та посилення їх загибелі некротичним шляхом можуть відігравати значну роль у розвитку імуноопосередкованих захворювань. Показники ушкодження ДНК у лімфоцитах периферичної крові можуть розглядатися як перспективні інтегральні біомаркери для оцінки тяжкості імуноопосередкованих захворювань та ефективності їх лікування.
Отримані результати мають високе прикладне значення для клінічної імунології та репродуктивної медицини. Крім того, вони мають важливе фундаментальне значення для клінічної фізіології, репродуктивної біології й імунології, оскільки відкривають можливості для розробки нових стратегій профілактики і лікування, а також формування терапевтичних підходів до збереження оваріального резерву та якості ооцитів, зокрема із застосуванням інгібіторів ПАРП-1, модуляторів HMGB1 і NF-κB та антиоксидантних наноматеріалів для обмеження хронічного запалення.
Description
Keywords
імуноопосередковане ушкодження, імунокомпетентні клітини, оваріальні клітини, інтегральна цілісність ДНК, ПАРП-1, амфотерин (HMGB1), NF-κB, оксидативний стрес, генотоксичний стрес, клітинна загибель, мейотичне дозрівання, антиоксиданти, наноматеріали
Citation
Грушка Н.Г. Механізми функціонування імунокомпетентних та оваріальних клітин при активації імунної відповіді. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 «фізіологія людини і тварин». – Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця Національної академії наук України, Київ, 2026.