На здобуття ступеня доктора наук

Permanent URI for this collection

https://repository.biph.kiev.ua/handle/123456789/6

Browse

Now showing 1 - 11 of 11

Вплив епілептиформної активності на функціонування головного мозку щурів
(2016) Ісаєва Олена Валентинівна; Кришталь Олег Олександрович академік НАН України, доктор біологічних наук
У дисертаційній роботі представлені результати морфофункціональних досліджень наслідків епілептиформної активності в період раннього розвитку на функціонування головного мозку щурів, а також механізмів розвитку набутої епілепсії, спровокованого формуванням епілептичного статусу. Проведено детальний аналіз морфологічних та електрофізіологічних змін у головному мозку щурів та змін поведінкових феноменів у цих тварин, спричинених впливами епілептиформної активності. Встановлені деякі загальні закономірності і механізми пластичних змін синаптичної передачі у тварин з історією неонатальної епілептиформної активності. Виявлені особливості модуляції збуджувальної та гальмівної синаптичної передачі, показані тривалі зміни збудливості нервових мереж і синаптичної пластичності у щурів з наявністю епілептиформної активності в період раннього розвитку. Досліджено вплив епілептиформної активності, локалізованої в префронтальній корі, на різні форми поведінки дорослих щурів. Вперше досліджено роль тромбіну і його молекулярних рецепторів, протеазаактивованих рецепторів 1, в епілептогенезі спровокованому формуванням епілептичного статусу. Встановлено нейропротекторний та антиепілептогенний ефекти інгібування цих рецепторів.
Фізіологічні та молекулярно-генетичні фактори фізичної працездатності у спорті
(2016) Дроздовська Світлана Богданівна; Ільїн Володимир Миколайович доктор біологічних наук, професор
Робота присвячена вивченню генетично обумовлених особливостей фізичної працездатності у спорті. Дослідження функціональних показників організму спортсменів з різними генотипами та рівня експресії генів у різних умовах показало, що поліморфізми генів, викликаючи кількісні та якісні зміни білків, зміни або втрату їх функціональної активності, обумовлюють індивідуальні відмінності у проявах фізичної працездатності та є прогностичними маркерами схильності до її розвитку. Визначено перелік генів, продукти яких впливають на процеси адаптації до напруженої м’язової діяльності і можуть слугувати молекулярно-генетичними маркерами розвитку як фізичних якостей зокрема, так і фізичної працездатності в цілому. Вперше було встановлено особливості генотипів спортсменів різних видів спорту. Автором запропоновано алгоритм визначення спадкової схильності до прояву високої фізичної працездатності у різних видах спорту
Вплив трансплантації стовбурових клітин на процеси регенерації нервової тканини після ішемічного ушкодження головного мозку
(2018) Цупиков Олег Михайлович; Скибо Галина Григорівна, доктор медичних наук, професор, завідувач відділу цитології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
У дисертаційній роботі представлені результати морфофункціональних досліджень впливу трансплантації стовбурових клітин різного ґенезу на процеси регенерації нервової тканини головного мозку та поведінкові феномени на різних моделях ішемічного ушкодження головного мозку як у дорослих, так і у новонароджених тварин. Продемонстровано, що трансплантовані фетальні GFP-позитивні нейральні прогеніторні клітини (НПК) здатні мігрувати в ушкоджені ділянки зони СА1 гіпокампа, диференціюватися як в астроцити, так і в зрілі нейрони, які утворюють синаптичні контакти з нейронами реципієнта. Показано, що ішемічне ушкодження гіпокампа викликає порушення когнітивних функцій (просторової пам’яті), а стереотаксична трансплантація НПК сприяє відновленню просторової пам’яті у тварин після ішемічного ушкодження мозку. На створеній in vitro моделі ураження білої речовини головного мозку – перивентрикулярної лейкомаляції – продемонстровано, що мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини в умовах їх безконтактного співкультивування зі зрізами головного мозку мають нейропротекторний вплив на нервову тканину, зменшуючи реактивний астро- та мікрогліоз та збільшуючи кількість олігодендроцитів. Досліджено вплив трансформації НПК у напрямку надекспресії FGF-2 на поведінку цих клітин після їх трансплантації у соматосенсорну кору щурів з ішемічним ушкодженням мозку та показано можливість утворення ними локальних навколосудинних проліферативних кластерів із нейрогенним потенціалом. Уперше показано вплив трансформації ендогенних НПК у напрямку надекспресії EMMPRIN на міграційні здібності цих клітин та можливість утворення ними популяції нейральних прогеніторів у пошкодженій ділянці кори. Уперше показано формування нейронами ішемізованого мозку прямих синаптичних входів на інтракортикально трансплантованих клітинах, утворених з індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (іПСК) людини.
Механізми кардіопротекторної дії активації SUR-рецепторів калієвих каналів
(2018) Струтинський Руслан Борисович; Мойбенко Олексій Олексійович академік НАН України, доктор медичних наук, професор
В ході роботи показано, що захисний ефект активації SUR-рецепторів КАТФ-каналів реалізується за рахунок помірного зниження артеріального тиску, попередження реперфузійного підвищення загально-периферичного опору та опору коронарних судин, відносного збереження показників скоротливості міокарда, попередження значного зростання надлишкового індуцибельного і реутилізаційного та, навпаки, підвищення протективного конститутивного синтезу NO, значного пригнічення вільнорадикальних реакцій, зменшення утворення патогенних в умовах ішемії міокарда LTС4 та ТхB2, пригнічення деградації АТФ та значного утворення сечовини і сечової кислоти, підвищення вмісту сфінгозину, стимуляції гемоксигеназної реакції, мембранопротекторної дії та попередження відкривання мітохондріальної пори, апоптозу і некрозу. Вперше проведено генотипування мешканців України щодо поширення алельних поліморфізмів генів KCNJ11 та ABCC8, що кодують Kir6.2 та SUR1-рецептори КАТФ-каналу, та показано їх зв'язок з таким захворюванням як серцева недостатність. Виявлено, що у дорослих спонтанно гіпертензивних щурів (SHR) експресія генів, що кодують білки Kir6.1, Kir6.2 та SUR2 значно менша порівняно зі щурами Wistar-Kyoto (що може сприяти підвищенню судинного тиску), а у старих 18-ти місячних SHR щурів значно менша експресія SUR1- та SUR2-рецепторів, що може бути одним із механізмів декомпенсації недостатності серця.
Патогенетичне обґрунтування та розробка технології катетерного лікування фібриляції передсердь в залежності від структурно-функціонального та електрофізіологічного ремоделювання лівого передсердя
(2019) Горячий Олексій Володимирович; Гоженко Анатолій Іванович, доктор мед. наук, професор
Метою роботи було на основі дослідження механізмів ініціації та підтримки фібриляції передсердь і ролі сироваткових маркерів фіброзу та запалення встановити патогенетичні особливості структурно функціонального ремоделювання міокарду ЛП. Розробити патогенетично обґрунтовану методику лікування та визначити її клінічну ефективність. Для досягнення цієї мети було обстежено 210 пацієнтів з різними формами фібриляції передсердь (ФП). Основна група (1) – 130 пацієнтів з різними формами ФП, резистентної до медикаментозної терапії. Контрольна група (2) – 80 пацієнтів без порушень серцевого ритму і практично здорові пацієнти. Середній вік пацієнтів основної групи – (53,5±7,6) року, із них 54 (41 %) жінки і 77 (59 %) чоловіків. У пацієнтів контрольної групи середній вік становив (52,7±5,6) року, із них 31 (38,7 %) жінка і 49 (61,3 %) чоловіків. На основі дослідження, викладеного в дисертаційній роботі, вперше були отримані такі дані. Було виявлено, що аритмічний анамнез більше 10 років (р=0,007) і хронізація аритмічного процесу є незалежними предикторами для прийняття рішення про необхідність проведення оперативного втручання і наступної оцінки післяопераційного періоду. Виявлено тенденцію до зниження ефективності оперативного втручання у пацієнтів з наявною супровідною патологією серця. За результатами аналізу лабораторних показників встановлено, що рівень матриксної металопротеїнеази-9 був вищим в групі пацієнтів з післяопераційним рецидивом ФП – (186,0±26,9) нг/мл та (241,0±23,4) нг/мл, р<0,05 відповідно; рівень тканинного інгібітора металопротеїназ-1 (ТІМП-1) і С-кінцевого пропептиду колагену І типу (ЦТПК-І) також істотно відрізнялися в досліджуваних групах, з тенденцією до підвищення в групі з післяопераційним рецидивом ФП. Так, рівень ТІМП-1 в групі без рецидиву був (140,6±40,3) нг/мл порівняно з групою з рецидивом – (152,7±44,9) нг/мл, р<0,05 а рівень ЦТПК-І (92,5±24,4) і (164,4±28,8) нг/мл відповідно, р<0,05. Встановлено, що маркери запалення (С-реактивний протеїн (СРП), фактор некрозу пухлини альфа (ФНП-α), інтерлейкін-6 (ІЛ-6)) також мали суттєві відмінності між групами, з тенденцією до підвищення в групі з післяопераційним рецидивом ФП. Таким чином, рівень СРП в групі без рецидиву становив (1,9±0,9) мг/л порівняно з групою з рецидивом – (2,9±1,0) мг/л (р<0,05). Рівень ФНП-α в групі без рецидиву становив (4,5±1,1) пг/мл і (6,8±1,3) пг/мл відповідно (р<0,05). Рівень ІЛ-6 також був істотно вищим в групі пацієнтів з післяопераційним рецидивом ФП. Так, у групі без рецидиву рівень ІЛ-6 дорівнював (4,6±2,9) пг/мл порівняно з групою з рецидивом – (7,4±4,5) пг/мл. Слід зазначити відсутність достовірних відмінностей між групами за статтю, віком, особливостями проведеної медикаментозної терапії у розвитку пізніх рецидивів фібриляції передсердь у післяопераційному періоді. Проведений аналіз даних показав бінарність залежних змінних та відсутність лінійного взаємозв’язку між окремими можливими предикторами і ризиком розвитку ФП, тому для оцінки ймовірності розвитку рецидиву ФП ми обрали метод дискримінантного аналізу та регресивної моделі на основі коефіцієнтів кореляції, ефективність прогнозування яких лежить у діапазоні від 78,6 до 97,8 %. На основі отриманих результатів було розроблено моделі прогнозування ефективності лікування ФП. Показано, що за допомогою класифікуючих (дискримінантних) функцій, використовуючи наведені клінічні показники, можна ретроспективно передбачити відсутність рецидиву аритмії у 91 із 93 пацієнтів, рецидив через 2 роки – у 8 із 10, через 7 днів – у 11 із 14, відсутність ефекту – у 9 із 11 хворих. Враховуючи наведені дані, визначивши тяжкість ФП та рівень структурних змін міокарда, ми маємо можливість на доопераційному етапі розробити індивідуальну тактику лікування пацієнтів з ФП, незважаючи на її форму та тривалість. Альтернативним підходом для прогнозу ефекту операції є створення на основі коефіцієнтів кореляції регресивних моделей залежно від наявних клінічних параметрів (від 4 до 9 показників) та визначення індексів ефективності для кожного з них. У щоденній клінічній практиці для оцінки ефективності лікування ФП слід використовувати показники ензимів (ММП-9, РICP, ТІМП-1) і цитокінів (СРП, ФНП-α, ІЛ-6) як опорні маркери при побудові прогностичних моделей.
Міжклітинні взаємодії та ендогенні механізми нейропротекції у гіпокампі при моделюванні ішемічного пошкодження
(2019) Лушнікова Ірина Василівна; Скибо Галина Григорівна, член-кореспондент НАН України, доктор медичних наук, професор, завідувач відділу цитології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
У роботі представлено комплексне дослідження різних типів гіпокампальних клітин, міжклітинних взаємодій та ендогенних механізмів нейропротекції при моделюванні ішемічного ушкодження in vitro з використанням культур гіпокампа та киснево-глюкозної депривації (КГД). Показано, що в умовах, коли пірамідні нейрони ушкоджуються і гинуть, інтернейрони зберігають життєздатність, а астро- та мікроглія активуються. Проаналізовані зміни пластичності збудливих і гальмівних синапсів та гліальних відростків у найбільш чутливій СА1 зоні культивованих зрізів при КГД. Виявлено, що інтернейрони є ацетилхолінчутливими та з’єднані електричними контактами, що може обумовлювати їх КГД-резистентність. Ушкодження СА1 нейронів в умовах КГД може бути пов’язане з редукцією гліцинових рецепторів. Показано, що нейронні молекули клітинної адгезії (NCAM) задіяні у порушеннях синаптичної пластичності. Синаптичні трансмембранні білки пресенілін-1 і синаптотагмін-1 координують ефективність синаптичної передачі. Показано важливу роль гіпоксія-індукованих факторів (HIF) у життєздатності нейронів при КГД. Нейропротекторний вплив аноксичного прекондиціювання асоціюється з підвищеним рівнем експресії HIF у нейронах та опосередкований стабілізацією роботи Са2+-АТФаз. Виявлено взаємозв’язок NCAM- та HIF-опосередкованих механізмів. Мультипотентні мезенхімальні стромальні стовбурові клітини мають нейропротекторний вплив при контактному і безконтактному кокультивуванні зі зрізами після КГД. Досліджені молекулярні механізми ішемічного пошкодження можуть бути новими фармакологічними мішенями при ішемії мозку.
Вплив мутацій кальційзв’язуючих білків та змін депо-залежного входу іонів кальцію на функціювання збудливих та незбудливих клітин
(2020) Грищенко Олексій Вадимович; Білан Павло Володимирович, доктор біологічних наук, професор
У роботі представлені результати комплексного дослідження клітинних та молекулярних механізмів, залучених до кальцієвої регуляції в клітинах різних типів. У кардіоміоцитах як типових представниках електрозбудливих клітин, що здатні до скорочення, показана важлива роль кальційзв’язуючих білків у формуванні та регуляції змін внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію. Проаналізовано зміни електричних характеристик потенціалів дій та біофізичних параметрів скорочення кардіоміоцитів, викликаних мутаційними модифікаціями молекул тропоніну Т, що збільшує чутливість міофіламентів кардіоміоцитів до іонів кальцію. Показано, що з ростом чутливості міофіламентів пропорційно збільшується буферна кальцієва здатність клітин, і саме цим можуть бути пояснені зміни електричної та скорочувальної активності “мутантних” кардіоміоцитів. В електрично незбудливих клітинах одну з провідних ролей у підвищенні внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію відіграють кальцієві канали, що активуються вивільненням цих іонів із ендоплазматичного ретикулуму та його спустошенням. За допомогою методу “patch-clamp” вперше зареєстровані кальцієві струми в ацинарних клітинах, що виникають у відповідь на спустошення ретикулуму. Експериментально продемонстровано пряму кореляцію між спустошенням ендоплазматичного ретикулуму та активацією депозалежного струму. Доведено, що саме вхід іонів кальцію через депозалежні канали являє собою основний фактор, що призводить до некрозу клітин при більшості патологій, котрі призводять до виникнення гострого панкреатиту. Із застосуванням конфокальної мікроскопії з’ясовані механізми кальцієвої регуляції в клітинах лобул екзокринної частини підшлункової залози, зокрема в нервових, зірчастих та імунних клітинах. Встановлено, що зірчасті клітини в звичайних умовах (за відсутності патологій) здатні генерувати кальцієві транзієнти у відповідь на прикладання брадикініну; описані механізми виникнення і генерації цих кальцієвих транзієнтів. В роботі вперше описані вірогідні механізми виникнення гострого панкреатиту, спричиненого дією аспарагінази і експериментально обґрунтовано можливий новий підхід у терапії гострого панкреатиту; в основі такого підходу лежить застосування галактози, що забезпечує адекватне регулювання необхідної концентрації АТФ в ацинарних клітинах підшлункової залози.
Клітинні та молекулярні спінальні механізми ноцицепції як мішені для корегування хронічних больових синдромів
(2020) Копач Ольга Володимирівна; Войтенко Нана Володимирівна, доктор біологічних наук, професор
У роботі представлено комплексне дослідження клітинних та молекулярних механізмів, що залучені у підтримання хронічного болю різного генезу у нейронних мережах дорзального рогу (ДР) спинного мозку. Продемонстровано, що порушення динамічного обігу (трафікінгу) AMPA-рецепторів, які містять GluR1 та GluR2 субодиниці, у синапсах та позасинаптичних ділянках мембрани нейронів ДР лежать в основі розвитку та підтримання хронічного болю. Встановлений молекулярний механізм таких порушень при периферичному запаленні та охарактеризовано каскад внутрішньоклітинних білків (старгазин, ABP/GRIP, PICK1), які залучені у регуляцію обігу AMPA-рецепторів між синаптичною та позасинаптичними мембранами за участю ключового ферменту протеїнкінази С підтипу α (РKСα). Експериментально продемонстровано, що порушення трафікінгу AMPA- рецепторів призводить до змін у балансі між синаптичним збудженням та гальмуванням у мережах ДР, що спричиняє довготривалу збудливість ДР спинного мозку – феномен центральної сенситизації. Останній, як вважається, опосередковує розвиток і підтримання хронічного болю різного генезу. Вперше продемонстровано клітинноспецифічність порушень трафікінгу AMPA-рецепторів у сенсорних нейронах та зміщення балансу між синаптичним збудженням та гальмуванням у мережах ДР спинного мозку. Виявлені зміни вперше в світі демонструють причинно-наслідкові зв’язки між порушеннями регуляції динамічного обігу AMPA-рецепторів на клітинному рівні та розвитком і підтриманням хронічного болю. Розроблено та експериментально обґрунтувано новий підхід для потенційно нової терапії хронічних больових синдромів із врахуванням ключової ролі спінальних механізмів у підтриманні хронічного болю різного походження. В основі такого підходу лежить корегування порушень у ланці молекулярного каскаду, що опосередковує регулювання трафікінгу AMPA-рецепторів у сенсорних нейронах ДР спинного мозку. Уперше продемонстровано терапевтичні ефекти фармакологічного блокування Ca2+ -проникних AMPA-рецепторів високоселективними сполуками-інгібіторами нового покоління (активаційнозалежними блокаторами ІЕМ-1460 та ІЕМ-1925) на полегшення больового синдрому із мінімальними побічними ефектами. Вперше застосовано генну терапію хронічного болю в експериментальній моделі CFA-індукованого периферичного запалення і доведено терапевтичну доцільність корегування порушень молекулярного механізму регуляції трафікінгу AMPA-рецепторів у нейронах ДР спинного мозку при тривалому периферичному запаленні. Науково обґрунтовано терапевтичні ефекти на клітинному рівні.
Механізми органічного ураження головного мозку і методи їх корекції
(2020) Яценко Катерина Валентинівна; Скибо Галина Григоріївна, член-кореспондент НАН України, доктор мед. наук, професор
У дисертаційній роботі представлений детальний аналіз патогенетичних механізмів розвитку перивентрикулярної лейкомаляції (ПВЛ) та досліджений вплив комплексного лікування з застосуванням транскраніальної мікрополяризації на морфо-функціональний стан ЦНС дитини при органічних ураженнях головного мозку. На in vivo моделі ПВЛ показано, що ПВЛ призводить до ушкодження мієлінової оболонки нервових волокон (деградації основного білка мієліну) та реактивного гліозу. Уперше на створеній in vitro моделі ПВЛ показано, що спільна дія киснево-глюкозної депривації (КГД) та ліпополісахаридів (ЛПС) має найбільш пошкоджуючий вплив на нервову тканину порівняно з кожним із цих чинників окремо. Уперше на короткостроковій культурі дисоційованих клітин гіпокампа показано, що мікрополяризація підвищує метаболічну активність нервових клітин у нормі та запобігає їх ушкодженню при моделюванні процесу нейрозапалення, а також впливає безпосередньо на нейритогенез. Аналіз ЕЕГ даних пацієнтів з органічними ураженнями головного мозку, в комплексне лікування яких додавалася транскраніальна мікрополяризація, продемонстрував більш виражену позитивну динаміку параметрів ЕЕГ. Показано, що позитивна динаміка електронейроміографічних показників після курсу мікрополяризації свідчить про поліпшення функціонального стану нейром'язового апарату. Продемонстровано, що мікрополяризація в пацієнтів з органічними ураженнями головного мозку забезпечує позитивну динаміку показників транскраніальної доплерографії судин голови. Одержані результати дають підстави стверджувати про доцільність використання транскраніальної мікрополяризації у комплексній реабілітації дітей з органічними ураженнями головного мозку.
Механізми розвитку гіпометаболічного стану при гіпоксії та нові підходи до патогенетичної корекції гіпоксичних і метаболічних порушень
(2021) Портніченко Володимир Ілліч
Дисертацію присвячено дослідженню основних механізмів впливу різних видів гіпоксії на енергетичний обмін та визначенню нових підходів до патогенетичної корекції метаболічних порушень. Дослідження проведено на щурах лінії Вістар при впливі гострої, періодичної, хронічної гіпоксії, моделюванні первинної, респіраторної гіпоксії та іммобілізаційного стресу; охарактеризовано статеві та онтогенетичні відмінності. Клінічні дослідження проведено на добровольцях середнього та похилого віку, а також хворих з метаболічним синдромом, предіабетом, діабетом 1 і 2 типу, мешканцях рівнини та середньогір’я, при впливі гострої, хронічної, переривчастої інтервальної гіпоксії. Одержані результати свідчать, що основною реакцією на вплив різних видів гіпоксії є розвиток гіпометаболічного стану, пов’язаного з порушенням синтезу АТФ в клітинах. Встановлено, що ключову роль у його розвитку відіграє стабілізація факторів транскрипції HIF-1α і HIF-3α, які стимулюють активацію захисних і адаптивних генів, в тому числі, iNOS, MnSOD, кавеоліну-3, Akt, GLUT-1 i -4. Активуються стійкі до гіпоксії білки аеробної частини енергетичного обміну і гліколіз. Також внаслідок дії гіпоксії спостерігається мітохондріальна дисфункція, порушення роботи комплексу І, зниження окиснення НАД-залежних і домінування окиснення ФАД- залежних субстратів, розвиток окисного стресу та гіперглікемічної реакції. Комплексні зміни метаболічних параметрів вказують на спільні риси стрес-реактивних механізмів та відповіді на гіпоксію різного генезу. Встановлено фазовий характер змін метаболізму у відповідь на гіпоксію різного генезу та стрес. Гіпометаболічна фаза триває 5-9 діб в залежності від глибини і тривалості гіпоксичного стимулу. Після нетривалої перехідної фази розвивається гіперметаболічна фаза, яка характеризується значним зростанням енергетичного метаболізму і HIF-залежним обмеженням функції HIF-1. В мітохондріях зростає спряження окиснення з фосфорилюванням, відновлення функціонування комплексу 1 електронтранспортного ланцюга, домінування окиснення НАД-залежних субстратів над ФАД-залежними, зростання продукції АТФ, знижується теплопродукція. Відповідно до підвищення споживання кисню зростає функція зовнішнього дихання. Зростає експресія інсулінових рецепторів та транспортерів глюкози, розвивається гіпоглікемія, а при метаболічних порушеннях спостерігається покращення вуглеводного і ліпідного метаболізму. Через 16-18 днів розвивається адаптивна фаза, нормалізуються функціональні показники організму і встановлюється новий стан енергетичного обміну організму, при якому реакція на гіпоксичний або стресорний стимул зменшується або відсутня. Важливим результатом є встановлення факту, що на зміну фаз не впливає рівень готовності кисеньтранспортної системи до підвищення метаболічних потреб тканин, що є фактором ризику. Розроблені методи корекції та теоретичні висновки дозволяють рекомендувати призначення глюкокортикоїдних гормонів як складових патогенетичної терапії, що дозволяє відтермінувати настання гіперметаболічної фази, а також лікування наночастинками церію для корекції порушень у гіпометаболічній фазі.
Ріанодин рецептор опосередкована кальцієва сигналізація в м’язових і нервових клітинах
(2024) Шкриль В'ячеслав Михайлович
У роботі представлені результати комплексного дослідження клітинних та молекулярних механізмів, які беруть участь у регуляції внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації у м’язових і нервових клітинах шляхом вивчення ролі ріанодинових рецепторів (RyRs). Ці рецептори відповідають за вивільнення кальцію з сарко/ендоплазматичного ретикулуму в цитозоль. Процес вивільнення кальцію з депо має велике значення для функціонування м'язів і нервової системи. На локальному рівні активність RyRs реєструється як кальцієві спалахи, які розглядалися як локальні зміни концентрації кальцію під час його вивільнення з саркоплазматичного ретикулуму (СР) внаслідок одночасного відкриття декількох RyRs. Розуміння динаміки Са2+ спалахів є важливою для кальцієвої сигналізації. Численні експериментальні, комп’ютерні та біофізичні дослідження були спрямовані на вивчення механізмів ініціації, припинення та регуляції кальцієвих спалахів. Розуміння ролі як спалахів, так і роботи залучених RyRs на рівні регуляції та динаміки кальцієвого сигналу у нормі та патології слугує основою для з’ясування функціональних змін Са2+ сигналу на клітинному або субклітинному рівнях. Актуальність досліджень ріанодинових рецепторів в кальцієвій сигналізації полягає в тому, що вони є потенційними мішенями для розвитку нових ліків від різних захворювань, пов'язаних з порушенням кальцієвої концентрації в клітинах. Наприклад, деякі хвороби м'язів, такі як дистрофія скелетних м’язових волокон, аритмії серця, а також нейродегенеративні захворювання, можуть бути пов'язані зі зміною функціональності RyRs. Для детального дослідження ріанодин рецептор опосередкованої кальцієвої сигналізації було застосовано наступні біофізичні методики: епіфлуоресценція та конфокальна мікроскопія з використанням кальцій-чутливих флуоресцентних барвників для визначення динаміки концентрації кальцію; метод петч-клемп для реєстрації трансмембранних Ca2+ струмів; локальне вивільнення зв'язаного кальцію під час фотолізного спалаху з кальцієвого буфера; комп'ютерне моделювання та обробка кальцієвих сигналів для розрахунку кальцієвих потоків; статистична обробка отриманих результатів. У даному дослідженні властивості кальцієвих спалахів у кардіоміоцитах передсердь були вперше досліджені за допомогою чотиривимірної конфокальної мікроскопії. Були запропоновані алгоритми для виявлення спалахів Са2+ у місці вивільнення. Попередньо під час конфокального сканування ліній або площини клітини спонтанні Са2+ спалахи реєструвалися розфокусованими, оскільки місце їхнього виникнення невідомо. В даній роботі зареєстровані спалахи, які знаходилися в місці вивільнення, мали вищу амплітуду порівняно з іншими розфокусованими спалахами. Було показано, що амплітуда Са2+ спалахів зареєстрованих у місці вивільнення мали модальний розподіл. Струм вивільнення Са2+, що лежить в основі такого спалаху, становив приблизно 11 пА, що свідчить про активність між 20 та 30 відкритими RyRs. Ця методика дозволяє досліджувати RyRs, визначати потік вивільнення з великою достовірністю, що дає можливості використати її для фармакологічних досліджень ріанодинових рецепторів. Для детального вивчення динаміки кальцію в кардіоміоцитах із високою часовою роздільною здатністю була застосована методика надшвидкісної конфокальної візуалізації. Це дозволило виявити ступінчасту кінетику зростаючої фази спалахів Са2+, та підтвердити участь групи каналів RyRs. Двовимірна реєстрація транзієнтів Са2+ в міоцитах шлуночка демонструє асинхронну активацію сайтів вивільнення, при відкритті RyRs. З латентністю в 2.5 мс після подачі електричного стимулу спостерігався вхід Са2+, який супроводжувався вивільненням Са2+ з СР з додатковою затримкою в 3 мс. Пік вивільнення Са2+ спостерігався через 4 мс після його початку. Показано, що динаміку збільшення Ca2+, який входить у кардіоміоцит та кальцій-індукованого вивільнення кальцію можливо достовірно розділити на рівні окремих центрів вивільнення кальцію як у клітинах передсердя, так і у шлуночків міокарда, як у часі, так і просторі. Було отримано перші прямі докази того, що в міоцитах передсердь зміна кінетики реституції вивільнення Ca2+ з саркоплазматичного ретикулуму від стимулу до стимулу є ключовим причинним механізмом виникнення Ca2+-альтернацій, як важливий механізм утворення серцевої аритмії. Показано, що просторово обмежене фотовивільнення Са2+ та інозитол-3-фосфату дозволяє регулювати активність RyRs через механізм кальцій-індукованого вивільнення кальцію (CICR). Це додатково може допомогти вивчити альтернації серця, та надає можливості розробки нових стратегій лікування аритмій серця. В даній роботі було ідентифіковано мікродомени в скелетних м'язах, де кальцій, що вивільняється з СР, має прямий доступ до мітохондрій. Була виявлена кореляція між активністю RyRs та окислювально-відновним потенціалом мітохондрій у клітинах скелетних м'язів, як фактор появи спонтанних кальцієвих спалахів. Встановлено, що активні форми кисню можуть регулювати RyRs та вивільнення Ca2+ із СР. Надмірне утворення ROS та аномальні сигнали Ca2+ в дистрофічних скелетних м'язах є взаємопов'язаними явищами, утворюючи порочне коло шкідливих подій, які сприяють аномальній чутливості при осмотичному стресі. Було виявлено значно збільшену експресію NAD(P)H-оксидази у скелетних м'язах миші лінії mdx, що сприяло підвищеному утворенню ROS. При осмотичному шоці, додатково відбувається збільшення мітохондріального кальцію та посилення утворення мітохондріального ROS в mdx скелетних м’язових волокнах порівняно з нормальними. Кальцій-індуковане вивільнення кальцію, яке відбувається через активацію RyRs кальцієм, було досліджено за допомогою методу штучного локалізованого підвищення концентрації кальцію (SLICs) на м'язових волокнах амфібій та ссавців. В скелетних м'язових клітинах жаби SLICs індукували CICR-відповіді з пороговим значенням [Ca2+] для ініціації реакції на рівні 0.5 мкМ, підтверджуючи роль CICR за фізіологічних умов у скелетних м'язах амфібій. Проте у скелетних м'язових волокнах миші було зафіксовано, що RyRs не активуються при концентрації кальцію аж до 8 мкМ. Це, разом з високим пороговим значенням активації RyRs, може пояснювати слабку реакцію вивільнення кальцію, навіть за умов, що агенти, які активують RyRs, були присутні в великих концентраціях. Це суперечить гіпотезі про фізіологічну роль CICR у механізмі збудження-скорочення у скелетних м’язах ссавців. Дослідження ролі ріанодинових рецепторів у регуляції внутрішньоклітинного кальцієвого сигналу в пірамідних нейронах гіпокампу показало, що відповіді на електричну стимуляцію включають в себе кальцієві сигнали, подібні до тих, що спостерігаються в міоцитах передсердь. Аналіз показав асинхронний та затриманий ріст концентрації вільного кальцію в окремих ділянках нейрона. Було зафіксовано затримку у зростанні концентрації вільного Ca2+ в центральній ділянці порівняно з примембранними ділянками та дендритного дерева. Активація ріанодинових рецепторів за допомогою кофеїну призводила до швидкого збільшення [Ca2+] у примембранній зоні, дендритному дереві та центральній ділянці. Більш коротка електрична стимуляція не викликала збільшення сигналу Ca2+ через кальцій-індуковане вивільнення кальцію. Для вивільнення кальцію з ендоплазматичного ретикулуму через RyRs була необхідна тривала електрична стимуляція. Порушення регуляції функції RyRs пов'язане з різними захворюваннями, і розуміння механізмів, які регулюють активність RyRs, має вирішальне значення для розробки терапевтичних стратегій. Результати цього дослідження не тільки поглиблять наше розуміння фундаментальних принципів внутрішньоклітинної Ca2+ сигналізації, але надають уявлення про молекулярну основу різних захворювань, пов'язаних з дисфункцією RyRs. Був запропонований новий метод просторової, складної, дифракційно-обмеженої фотоактивації та фотовивільнення в живих клітинах. Така методика дозволяє локально активувати окремі сайти вивільнення кальцію або групу RyRs каналів у живих клітинах, що може бути використано для вивчення їхніх структурних і функціональних деталей з високою точністю. Також була адаптована та модифікована формула Грінкевича для визначення вмісту вільного кальцію в клітині при двох хвильовому методі збудження флуоресцентного барвника, при використанні для реєстрації сигналів ПЗЗ камерою. Адаптація включає в себе корекцію фотознебарвнення та виправлення помилки віднімання фону. Також був розроблений підхід, який розширює чутливість кількісної концентраційної візуалізації до приблизно 1000-кратного діапазону концентрацій і з необхідними рівняннями для інтерпретації флуоресцентних зображень, отриманих за допомогою пари флуоресцентних барвників з однаковим флуорофором, але різною константою дисоціації для кальцію. Отримані дані щодо змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію в м’язових і нервових клітинах, вказують на складний процес регуляції кальцієвого сигналу. Мітохондрія, залежно від її функціональної близькості до СР, бере активну участь у регуляції внутрішньоклітинної концентрації кальцію і може модулювати активність RyRs через механізми, що включають АТФ і ROS. Регуляція кальцієвого сигналу відбувається завдяки змінам активності ріанодинових рецепторів, які модифікують своє функціонування через зміну окислювально-відновного потенціалу мітохондрій, впливу активних форм кисню, NAD(P)H-оксидази, а також в залежно від їхнього функціонального розташування на периферії або в центрі клітини, і модуляцію самим кальцієм.

Browse

Browsing На здобуття ступеня доктора наук by Issue Date

Results Per Page

Sort Options